根據(jù)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)案例，以下為大家分享免疫熒光技術(shù)的操作方法流程。

免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence，IF）是根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原物質(zhì)或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。

免疫熒光技術(shù)的操作流程：

（1）選取一抗時(shí)要來源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。

（2）我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育。抗體濃度、孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。

（3）我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對照是PBS+熒光標(biāo)記物。

（4）封閉血清與二抗來源動(dòng)物一致，我用的是10%的正常donkey血清。

（5）其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。

免疫熒光技術(shù)的使用方法：

（1）直接熒光法 將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少；缺點(diǎn)是敏感性偏低，而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等病原微生物的快速鑒定。

（2）間接熒光法 用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢查，但非特異性反應(yīng)亦增加。染色程序分為兩步，首先用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體；然后加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果*步發(fā)生了抗原-抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。 由于免疫熒光技術(shù)的特異性、快速性和在細(xì)胞和分子水平定位的敏感性與準(zhǔn)確性，在動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫方面得到了廣泛應(yīng)用。