1. 酶和底物：在ELISA試劑盒中zui常用的酶為HRP和ALP。
2. 抗原  
在ELISA試劑盒中應用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。自然抗原的純度不高，特異性不強；合成抗原一般為多肽片段，缺乏天然抗原所具有的立體結構表位，親和力不高，可能導致相應表位的抗體漏檢；基因重組抗原具有安全、特異性強、親和力高、產量大等特點，是一種比較理想的抗原，但其純化比較困難。 
3. 抗體  
在ELISA試劑盒中應用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡單，但抗血清成分復雜，除含針對抗原（多個表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對要低于單抗，且制備周期長，批間差異較大。而單抗僅針對抗體的單一表位，親和力和特異性均較多抗高，且制備技術成熟，產量大，批間差異小，但結合位點的單一也正是其弱點之所在，在雙抗體夾心法中，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結合位點的缺乏，容易造成假陰．性結果。ELISA試劑盒在使用雙單抗一步法時，應注意抗原過剩時的“鉤狀效應"。